液相如何改善峰形与提升分离度？

那么，影响“色谱芯”的分离效果有哪些因素呢？下面我们将简要概述色谱柱所涉及的公式和理论，希望能帮助您遇到问题时进行排查。

柱效用于比较不同色谱柱的性能。柱效可能是描述色谱柱性能引用频率最高的参数之一，以理论塔板数 N 表示。

塔板数高的色谱柱柱效更高。理论塔板数高的色谱柱与理论塔板数低的色谱柱相比，在给定保留时间内的色谱峰更窄。

【资料图】

柱效能反映分离峰的宽窄。柱效高，分离峰窄，才可能有好的分离度。柱效高是高分离度的前提。柱效受柱参数（内径、柱长、粒度）、洗脱液类型（特别是粘度）、流速或平均线速度的影响。柱效还受化合物及其保留的影响。

常使用每米理论塔板数（N/m）进行色谱柱的比较，但需要在相同的色谱温度条件和峰保留（k）下进行。对于较小的固定相，柱效对分离更为重要。

过去称为容量因子或 k′（k 值），保留因子是指样品组分停留在固定相中相对其驻留在流动相中的时间之比。用保留时间除以峰不保留时间（t0）进行计算。

分离因子是对两个色谱峰之间时间或距离的最大测量值。如果 α = 1，则两个色谱峰具有相同的保留时间并共洗脱。

选择性因子的定义是容量因子之比。在图 1 中，您会看到，峰 A 和峰 B 之间的选择性比峰 B 和峰 C 的选择性更好。图中提供了计算说明。

改变流动相或固定相都可以改变选择性。温度也是调节选择性的一个因素。

分离度代表色谱柱分离目标峰的能力，因此，分离度越高，两峰之间越容易得到基线分离。从方程 5 中可以看出，分离度与柱效、选择性和保留值相关。可以通过改善这些因素来提高分离度。

在图 2 中，我们可以看到每个参数在分离过程中的不同作用。所有这些参数都呈效应递减趋势。即取值越大，对分离度的影响就越小。

如果将柱长加倍，将得到更多的理论塔板数，但分离时间也将延长 2 倍，而分离度只能得到 2 的平方根即 1.4倍的提高。

如果要对色谱峰进行定量，那么分离度最小应等于 1。分离度要达到 0.6，才能分辨两个等高峰间的峰谷。

如需建立耐用方法，理想分离度值一般应大于等于 1.7。基线分离并确保最准确定量结果的分离度应为 1.6。

压力方程（方程 6）包含影响系统压力的 5 个重要参数：溶剂粘度 (h)、流速 (F)、柱长 (L)、色谱柱半径 (r) 和填料粒径 (dp)。熟悉压力方程将能很好地理解这些重要参数对系统压力的影响。

van Deemter 方程是将柱效作为线速度（u）或流速的函数对柱效（用 H 表示，见方程 7）进行评价。

H – 称为塔板高度，或理论塔板高度，用柱长（L）除以理论塔板数进行计算。我们的目标是得到小塔板高度。

可以通过使用较小填料色谱柱、优化线速度，以及使用低粘度流动相，更有效地实现这一目标。随着粒径减小，优化线速度将增大。

当样品中存在各种类型的组分时，我们很难用等梯度洗脱（即，恒定流动相组成）在适当时间内让所有组分都得到分离。

梯度洗脱是一个随时间提高流动相强度的过程，最终使分析速度更快、峰形和定量结果更好。通过梯度洗脱，峰宽通常将更窄，并保持恒定。

在梯度方程中，S 为常数，与所分离的分子大小有关。小分子的 S 值约为 4 到 6，多肽和蛋白质的 S 介于 10到 1000 之间。

现在，经常使用不同尺寸的色谱柱，或使其更短（例如，为实现更高通量），或使用窄内径柱（如，用于质谱检测）。必须按比例缩短梯度时间（tG）或减小流速（F），以补偿柱体积的减少。

使用相同色谱柱时，如果想保持相同的梯度斜率和 k* 值，则需在梯度时间（tG）内按比例调整梯度组成（DF）改变速率或流速（F）。

文章来源：实验室经理人

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